超级英雄彼得-帕克(托比-马奎尔)在这一集里将顺利从中学毕业，考入一所虚构的“纽约大学”。他所要面对的敌人是外号叫做“章鱼博士”的奥托(艾尔弗雷德-奥里纳)……
彼得-帕克
自从自小孤儿、和姨父姨妈一起住在纽约皇后区的他，在一次学校活动中被一只基
因突变的蜘蛛咬了之后，彼得-帕克的生活被永远的改变了。他被赋予了不寻常的力量--蜘蛛的力量、敏捷和特有的官能。
在第二集中，彼得面临着新的挑战：如何运用“礼物同时又是诅咒”的力量，尽力去平衡他的双重身份-超级英雄和普通的高中生。他发现曾经贴近他的人和事物都渐渐疏远，他对玛丽-珍的感情日益强烈，他和哈里-奥斯本的关系也因为奥斯本发誓要为父亲向蜘蛛侠报仇而变得复杂起来。甚至连彼得的姨妈May也开始怀疑起他的侄子来了。
在这一集中彼得最大的敌人是章鱼博士，他必须用他的力量来打败这个多触须的八角形怪物。
玛丽-珍
她是彼得-帕克长期暗恋的对象，住在彼得的对门，有着家庭问题，但她一直把彼得当成她的好朋友并信赖与他。
两年后，在彼得拒绝了她并以苦涩的亲吻为结局之后，玛丽-珍继续追寻着她的明星梦。她有了新的住宅，新的朋友，和新的约会对象。但危险又一次悄悄地贴近了，他与蜘蛛侠之间的友谊使她成为可怕的章鱼博士(蜘蛛侠的新敌人)的目标。
章鱼博士
奥托博士是一个天才科学家，毕生致力于寻找能源来源的实验。当彼得经他的朋友哈里.奥斯本介绍见到奥托博士时，他感到一种莫名的恐惧。在妻子罗丝的支持下，奥托博士在他家里的实验室里日以继夜地研制着突破性的科学发明。但在一次新发明的示范中，可怕的事情发生了，奥托博士转变成了强大的、多角的章鱼博士……
哈里-奥斯本
哈里-奥斯本是彼得最好的朋友，但由于他的父亲诺曼-奥斯本被蜘蛛侠杀死和彼得卷入了他和玛丽-珍的三角恋而受到了考验。两年之后，彼得成了他父亲公司特别工程部门的主管，他们找到了新的项目，其中包括奥托博士的混合实验。他和彼得的关系随着他对蜘蛛侠日益增长的仇恨而变得复杂起来。当哈里把彼得介绍给他的偶像-奥托博士，同时也不经意地引发了一连串的可怕事件……
