1985年葛优拍摄了第一部影片《盛夏和她的未婚夫》，正式进入影视圈。
1988年葛优在影片《顽主》中扮演杨重一角，获得第9届中国电影金鸡奖最佳男主角提名；同年他在张艺谋执导的电影《代号美洲豹》中饰演一名劫机犯。

1989年参演滕文骥执导的电影《黄河谣》，扮演土匪头子黑骨头。1991年参演电影《烈火金刚》；同年在黄健中执导的电影《过年》中饰演好色又假正经的大姐夫，他凭借此片获得第15届大众电影百花奖最佳男配角奖。

1992年主演北京电视台推出的电视剧《编辑部的故事》，片中他饰演的李冬宝一角另其知名度提升；他亦凭借此片获得第10届中国电视金鹰奖最佳男主角奖；同年主演夏刚执导的电影《大撒把》，获得第13届中国电影金鸡奖最佳男主角奖。
1993年主演张艺谋导演的电影《活着》，这部电影是他表演上的转折点。《活着》是以男主角的坎坷命运为主线，时间跨度长，表演幅度大；剧中葛优饰演的福贵是一个嗜赌如命的纨绔子弟，不仅在赌桌上败光了全部家底，也使得老父恼羞成怒散手人寰。同年葛优在陈凯歌执导的电影《霸王别姬》中饰演袁四爷一角。

1994年凭借在《活着》中的表演，葛优获得第47届戛纳国际电影节最佳男主角奖，成为首位获此殊荣的华人演员。1996年他与姜文合演了周晓文执导的电影《秦颂》，片中葛优饰演悲剧音乐家高渐离。

1997年参演由许鞍华执导、改编自张爱玲小说的电影《半生缘》；同年在冯小刚执导的贺岁片《甲方乙方》中饰演姚远一角。1998年凭借《甲方乙方》获得第21届大众电影百花奖最佳男演员奖；同年参演冯小刚执导的电影《不见不散》，片中葛优饰演刘元。

1999年在冯小刚执导的电影《没完没了》中饰演出租车司机韩冬。2000年在电影《大腕》里出演电影厂的下岗摄影师。2002年凭借《大腕》获得第25届大众电影百花奖最佳男主角奖。

2003年主演冯小刚执导的电影《手机》，葛优饰演的严守一是一名电视台的主持人，主持《有一说一》的谈话节目，但这个人物在公众面前讲真话，生活之中却说假话。
2004年凭借电影《卡拉是条狗》获得第27届大众电影百花奖最佳男主角奖；同年出演冯小刚执导的电影《天下无贼》，饰演盗窃团伙首领胡黎。
2006年在冯小刚执导的《夜宴》中饰演有些神经质，同时还有些脆弱的厉帝。2007年在刘仪伟执导的《命运呼叫转移》中饰演纯朴憨厚的农民老三。2008年在冯小刚执导的电影《非诚勿扰》中饰演海归秦奋，与舒淇演绎了寻找真爱的童话。

2009年3月凭借《非诚勿扰》获得第三届亚洲电影大奖最佳男主角；12月担任首届澳门国际电影节评审委员会主席。2010年主演陈凯歌执导的电影《赵氏孤儿》，片中葛优饰演的程婴是一个有悖传统中国宗法伦理规范，弃亲生子不顾，将他人孩子抚育成人的悲情英雄；同年12月16日，葛优与姜文，周润发合演的电影《让子弹飞》在全国上映。

2011年8月凭借《赵氏孤儿》获得第14届中国电影华表奖最佳男演员奖；12月与英皇娱乐签下为期五年共三部影片的合约。2013年12月19日葛优主演的贺岁喜剧电影《私人定制》在全国上映。