15岁时参加上海电视台的综艺舞蹈队，正式自食其力自己赚取学费。
1993年，被选中主演电影《刘海粟》，那是她的第一次触电经历，收获800元片酬。
1994年，考入上海戏剧学院94级表演系本科。
1996年，在电视剧《真空爱情记录》中饰演夏文心，讲述了一群大学毕业生为了工作和爱情奋斗的故事。
1998年，毕业于上海戏剧学院，毕业后参演了第一部改编自陕西驻沪作家李春平同名小说的电影《玻璃是透明的》，马伊琍饰演“小丫子”，同年出演的第一部古装电影《孔乙己》至今没有公映。
2000年，出演了《黑洞》饰演演三陪女，马伊琍的表演事业得到了更好的提升，在电视剧《前世今生》中饰演美貌且气质超凡的秦婉莹。
2001年，出演电视剧《白天睡觉的女人》饰演李秀，在电影《西施眼》中饰演施雨，该剧在2002年美国夏威夷国际电影节中获评审团大将及亚洲最佳电影。
2002年，因出演电视剧《还珠格格Ⅲ之天上人间》中夏紫薇一角而被大众所熟知。
2004年，出演了由黄磊指导的《天一生水》饰演一个混血姑娘明妮。
2005年，出演张黎导演的电视剧《锦衣卫》在剧中就出演了一个这样的倾国美人客印月。
2006年，参演《乔家大院》扮演的“江雪瑛”
2007年，出演由赵宝刚指导的青春励志电视剧《奋斗》夏琳一角而知名度得到进一步的提升。
2008年，因拍电视剧《为谁心动》时无悔剃光了头，凭借影片《江北好人》，马伊琍战胜了李冰冰、范冰冰两位大热候选人，成为了长春电影节影后。
2009年，与佟大为共同出演了电视剧《婚姻保卫战》演出夫妻间事。 同年马伊琍出演了首部反映豫商故事的电视剧《经纬天地》在CCTV-8播出，这也是她继《乔家大院》之后首次登陆央视，马伊琍扮演尚达志的妻子顺儿，这也是马伊琍生产复出首部电视剧作品。
2010年，与涂松岩领衔主演的都市题材电视剧《双城生活》反映了“双城恋”话题，让许多观众产生了不小共鸣并引发了网络热议，而马伊琍在剧中饰演北京大妞郝京妮。凭借该剧获得国剧盛典2011年度最佳女演员。
2013年，年初马伊琍与杜淳、刘莉莉、陈思斯等众多明星合作的电视剧《青春期撞上更年期Ⅱ》，此外，还客串电影《不二神探》，并且彻底颠覆以往的形象。
2013年，首当制片人的马伊琍与首次当导演的丈夫文章合作的电视剧《小爸爸》。
2015年，出演了公路犯罪片《未择之路》。电视剧《北上广不相信眼泪》于11月7日在北京卫视、浙江卫视播出。
2015年7月16日，参演的民国时期战争题材作品《那些女人》正式杀青。
2016年1月，与陈建斌领衔主演的当代都市幽默轻喜剧《中国式关系》于在北京杀青。4月，在文章执导的谍战剧《剃刀边缘》中饰演女主角。
2017年，主演都市情感剧《我的前半生》，在剧中饰演罗子君，凭借该剧获得第24届上海电视节“白玉兰奖”最佳女主角。
2018年，凭借电影《那些女人》第21届上海国际电影节电影频道传媒关注单元最佳女配角奖；9月14日，其主演的犯罪电影《未择之路》上映，片中饰演一名卡车司机小眉；9月30日，与姚晨共同主演的剧情片《找到你》上映。

社会活动
2003年，马伊琍加入中华骨髓库，担任了“中华爱心大使”。
2009年09月25日，马伊琍在无锡获得了2009年度“中国国际年度绿色风云人物”，以表彰她在环保、低碳方面所做出的成绩。
2010年6月26日，马伊琍、文章共同发起关注艾滋病儿童的“We Can”艺术慈善计划，“WeCan”计划是在壹基金现有架构下，专门设立了“大福自闭症关爱基金”。
2011年，马伊琍拍摄公益写真，呼吁社会关注白血病儿童，代言了由邓飞等媒体人发起的“免费午餐”公益项目，旨在为贫困地区的孩子提供营养午餐。
2012年10月23日，电影《三个未婚妈妈》首映礼活动中，南通市委副书记陈斌为南通籍电影演员马伊琍颁发南通城市形象宣传大使聘书。
2011年3月22日，作为嘉宾出席了首届亚洲彩虹奖电视颁奖礼。
2012年5月17日，天使妈妈团队长沙成员“淘妈”通过确认，天使基金小飞专用账户已收到来自马伊琍和白百何的捐款。其中，马伊琍捐款四万元、白百何捐款十万元。
2015年10月22日，马伊琍获“联合国儿童基金会(UNICEF)”正式委任为中国大使。
2015年12月17日，俄罗斯总理梅德韦杰夫在俄罗斯驻华大使馆与中国青年代表座谈。许晴、黄晓明、马伊琍作为中国电影界代表出席活动，并受到俄罗斯总理接见。
2015年12月23日，作为嘉宾出席了第30届中国电视剧飞天奖典礼。
2016年3月24日，“尊尚门窗”与马伊琍签约品牌代言人的新闻发布会，在北京隆重举行。
2016年9月，由《南方人物周刊》杂志主办的第十二届中国青年领袖致敬盛典在北京揭开序幕，马伊琍获得“2016中国青年领袖”大奖。
2017年8月18日，马伊琍出席签约PINGO企业品牌代言人新闻发布会。
2018年1月31日，《中国慈善家》揭晓了“2017中国慈善名人榜”，马伊琍排名第22。